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2011-06-09收稿；2011-09-04接管
本文系宁夏天然迷信基金（No. NZ1147）帮助名目
* E-mail: gaozn@nxu.省略
1 引 言
延胡索酸泰妙菌素（Tiamulin fumarate, TF）是一种半发酵半分解双萜类新型植物公用抗生素（布局式见图1），它经由进程按捺微生物核糖体内感触感染性细菌卵白的分解，到达抗菌感化[1]。对延胡
图1 泰妙菌素的布局式
Fig．1 Structure of tiamulin
索酸泰妙菌素的研讨已报道的有反相高效液相色谱法（RP-HPLC）[2]、高效液相色谱法（HPLC）[3]、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）[4]、液相色谱-二极管阵列紫外光谱-串连质谱联用手艺（LC-DAD-ESI-MS）[5]和电化学方式[6,7]。而在电化学方式中首要集合在碳糊电极[6]和润色碳糊电极[7]上的电化学研讨，但TF在乙炔黑-离子液体复合润色玻碳电极上的电化学行动、电化学能源学及电化学阐发方式研讨任务还没有见报道。
乙炔黑具备杰出的电子传导性、较大比外表积和较强吸附才能等特征[8]，故被用于化学润色电极润色剂[9]。室温离子液体（RTIL）是指室温及临近室温下完全由阴、阳离子构成的液体物资[10]，具备电位窗口宽，生物相容性好和离子导电性高，能增进电子通报等特色[11]，是以引发了电化学任务者的极大乐趣。
本尝试在后期任务[6,7,12～14]根本上，将1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐 （[BMIM]PF6） 与AB夹杂, 制备了乙炔黑-离子液体复合润色玻碳电极（AB-ILs/GCE），研讨了TF在AB-ILs/GCE上的电化学行动及电化学能源学性子，并成立了TF含量的电化学定量测定方式。2 尝试局部
2.1 仪器与试剂
CHI660A电化学任务站（美国CHI仪器公司）；电化学测定接纳三电极体系：以CHI104 GCE （美国CHI仪器公司）和AB-ILs/GCE为任务电极，饱和甘汞电极（SCE）为参比电极，CHI115铂丝为辅助电极。
图2 差别电极的电化学阻抗谱图
Fig．2 Electrochemical impedance spectrum of acetylene black-ion liquid modified glassy carbon electrode （AB-ILs/GCE） （a）, AB/GCE（b） and GCE（c） in a mixture of 1.0 mmol/L K3Fe（CN）6-1.0 mmol/L K4Fe（CN）6 solution. Supporting electrolyte: 0.10 mol/L KCl. The frequency range is 0.1～105Hz.
TF质料药（宁夏多维泰瑞制药无限公司，批号：201005041）；TF打针液（赣州百灵植物药业无限公司，批号：080402）；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（[BMIM]PF6，纯度99%， 上海成捷化学无限公司）；尝试用水均为二次蒸馏水。
电化学测试前于电解池中通入高纯氮除氧5 min。本研讨所触及到的电位均为绝对SCE的电极电位，一切电化学测试均在室温下停止。
2.2 AB-ILs/GCE制备及电化学阻抗谱表征
GCE先用0.3
SymbolmA@ m α-Al2O3 抛光至镜面，用水冲刷清洁。再别离在丙酮和水中超声洗濯2 min， 以撤除残留氧化铝粉，晾干备用。精确称取8 mg AB并用微量取样器移取15
SymbolmA@ L [BMIM]PF6，将二者在研钵中夹杂研磨约20 min，获得糊状物，取少量糊状物均匀涂敷在已处置好的电极外表， 制得AB-ILs/GCE。电化学阻抗谱可表征电极外表润色进程中电阻变更信息[15]。以1.0 mmol/L Fe（CN）63
Symbolm@@ /4
Symbolm@@ 为电化学探针对GCE （图2c），AB/GCE（图2b）和AB-ILs/GCE（图2a）停止了电化学阻抗谱测试。由图2a可知，AB-ILs/GCE在高频区显现半圆弧（半圆弧直径代表电荷转移电阻），且其电荷转移电阻较着小于AB/GCE和GCE的电荷转移电阻，标明AB-ILs/GCE上有着较高导电性及较小的电荷转移电阻；而在低频区AB-ILs/GCE的直线斜率弘远于AB/GCE和GCE的直线斜率，申明在AB-ILs/GCE上电活性物资从溶液分散到电极外表的电阻减小，分散速度加快[16]。
3 成果与会商
3.1 TF伏安行动
在0.10 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4 （PBS, pH 6.8），扫描速度50 mV/s及电位窗口0.0～1.2 V的前提下，接纳CV研讨了1.0
SymbolmA@ mol/L TF在GCE（图3c），AB/GCE（图3b） 图3 TF的轮回伏安图
Fig．3 Cyclic voltammograms of 1.0×10
Symbolm@@ 6mol/L tiamulin fumarate （TF） at GCE （c）, AB/GCE（b） and AB-ILs/GCE （a） in 0.10 mol/L PBS. Scan rate: 50 mV/s及AB-ILs/GCE（图3a）上的伏安行动。如图3c所示，TF在GCE上于0.74 V 处显现一个不可逆氧化峰，氧化峰电流为2.847
SymbolmA@ A；TF在AB/GCE上亦于0.74 V处显现一个不可逆氧化峰，氧化峰电流为4.386
SymbolmA@ A。与GCE比拟，TF在AB/GCE的氧化峰电位根基不变，氧化峰电流增约莫1.8倍；比拟曲线a和曲线b发明，TF在AB-ILs/GCE的氧化峰电位略有负移，氧化峰电流增约莫3倍。此成果标明，TF电催化氧化反映是一个不可逆电极反映进程，且AB-ILs/GCE对TF电催化氧化具备杰出的催化感化。这可以或许或许是因为乙炔黑具备较大的比外表积，为TF的电催化氧化供给了较多的反映位点，加快了TF电子互换速度[8]；别的，离子液体的高离子导电性也可以或许或许进一步增进电子通报[11]。二者的协同感化使AB-ILs/GCE对TF的电化学氧化具备更好的催化感化。在10～400 mV/s规模内，接纳CV研讨了扫描速度对TF在AB-ILs/GCE上伏安行动影响。尝试标明，随扫描速度增添, TF在AB-ILs/GCE氧化峰电位Epa产生正移，峰电流Ipa增大，且峰电流Ipa与扫描速度平方根（v1/2）呈杰出线性干系，拟合方程为Ipa（
SymbolmA@ A）＝
Symbolm@@ 1.378＋2.778v1/2，R＝0.9962。该成果标明，TF在AB-ILs/GCE上电化学氧化是受分散步骤节制的电极反映进程。
3.2 尝试前提的影响
在电位窗口0.0～1.2 V，50 mV/s扫描速度下，别离以0.10 mol/L的KCl，Na2SO4，NaClO4，Na2HPO4-NaH2PO4（PBS, pH 6.8），NaAc-HAc，B-R （Britton-Robinson） 等为撑持电解质，对5.0×10
Symbolm@@ 5 mol/L TF停止CV测试。尝试标明，在PBS中TF具备杰出电化学行动，是以选用PBS为撑持电解质。
在pH 2.0～9.5 规模内考查了介质pH对TF伏安行动的影响。尝试标明，在pH 2.0～8.0规模内Epa随pH值增大而负移，其线性方程为Epa＝
Symbolm@@ 1124.60
Symbolm@@ 55.67（mV/pH），R＝0.9985。按照Ep（mV）＝E.0
Symbolm@@ （59m/n）/pH 获得m/n≈1；已知n＝2[7]，由此计较获得质子到场数m＝2，即TF在AB-ILs/GCE上电化学氧化进程是2个电子2个质子到场的不可逆电化学氧化进程；在pH 8.0～9.5规模内， Epa随pH值增添而根基不变。而在pH 2.0～6.0规模内， 氧化峰电流Ipa随pH值增添而降落； 在pH 6.0～9.5规模内， Ipa根基不变。
3.3 电化学能源学
3.3.1 电荷转移系数α 按照上述尝试成果，以Epa对logv作图，获得GCE及AB-ILs/GCE上Epa-logv干系，其线性方程别离为Epa （mV）＝63.62 logv＋635.4 （R＝0.9986），Epa （mV）＝149.0 logv＋551.3，（R＝0.9987）。斜率别离为63.62和149.0 mV。
按照完全不可逆分散节制进程方程式[17]：
Ep＝（blogv）/2＋C（1）
式中， C为常数， b为Tafel斜率，b＝2.3RTn（1
Symbolm@@ α）F。 由Epa-logv干系直线斜率可得b/2，即：b＝2
SymbolvB@ Ep
SymbolvB@ （logv） ， 已知n＝2[7]，是以计较获得α别离为0.77和0.90。
3.3.2 电极反映速度常数kf
平板电极上可逆电化学反映的电流呼应遵守以下干系式[18]:
I（t）＝nFAkfC（1
Symbolm@@ 2Ht/π）（2）
H＝kfD1/2Ox＋kbD1/2Rd（3）
对完全不可逆电极反映，kb＝0，H＝kf/D1/2Ox，接纳CA可以或许或许测得电极反映速度常数kf。由尝试测得TF在GCE及AB-ILs/GCE上的I（t）-t1/2干系曲线 图4 稳态电流-时候曲线
Fig．4 Time-dependent steady state currents obtained at AB-ILs/GCE while increasing TF concentration at 0.80 V with a stirring rate of 100 r/min截距别离为5.85×10
Symbolm@@ 4 及 3.21×10
Symbolm@@ 4，计较获得TF在GCE及AB-ILs/GCE上的电极反映速度常数kf别离为8.87×10
Symbolm@@ 2和1.23×10
Symbolm@@ 1s
Symbolm@@ 1。
在不异尝试前提下，操纵稳态电流-时候呼应曲线方式测定了TF在AB-ILs/GCE上的呼应电流与浓度干系（图4），TF电流呼应旌旗灯号随其浓度成比例增添，呼合时候小于5 s。最低呼应浓度为0.2
SymbolmA@ mol/L。本方式检出限低，活络度高，可作为TF电化学定量测定方式。
3.4 电阐发方式的利用
3.4.1 TF方波伏安行动 在电位窗口0.0～1.2 V及优化了的方波尝试前提 （优化方波尝试前提：振
图5 TF方波伏安图
Fig．5 Square wave voltammogram （SWV） of 1.0
SymbolmA@ mol/L TF at the at GCE （c）, AB/GCE （b） and AB-ILs/GCE （a） in 0.10 mol/L PBS
幅45 mV，方波频次5 Hz，电势增量6 mV） 下对1.0
SymbolmA@ mol/L TF停止SWV测试，获得TF 在GCE，AB/GCE及AB-ILs/GCE上的SWV曲线（图5）。TF在GCE上于0.70 V处显现一个不可逆氧化峰（图5c），TF在AB/GCE上亦于0.70 V处显现一个不可逆氧化峰（图5b）。与GCE比拟，TF在AB/GCE氧化峰电位不变，氧化峰电流增约莫2倍。比拟图5a与图5b发明， TF在AB-ILs/GCE上氧化峰电位与AB/GCE上氧化峰电位比拟略有负移，氧化峰电流增大2.1倍。此尝试成果与轮回伏安法所得成果根基分歧，进一步标明AB-ILs/GCE对TF电化学氧化具备杰出的催化感化。
3.4.2 电极重现性和不变性 统一支AB-ILs/GCE电极于5.0×10
Symbolm@@ 5 mol/L TF溶液CV扫描10次，其氧化峰电流RSD为1.9%；平行润色6次RSD为2.9%，标明建造的润色电极有杰出的重现性。电极在室温下放置48 h对， TF呼应电流的变更量在±5%之内，标明该电极具备较好不变性，电极寿命为30 d。
3.4.3 搅扰尝试 在不异尝试前提下，TF浓度为5.0×10
Symbolm@@ 5 mol/L， 考查了罕见离子和葡萄糖、蔗糖对TF催化氧化峰电流影响。尝试成果标明，1000倍无机离子K.＋，Na.＋，SO2
Symbolm@@ 4，Cl.
Symbolm@@ ，NO.
Symbolm@@ 3和50倍酒石酸、柠檬酸、葡萄糖、蔗糖对TF电流呼应旌旗灯号无搅扰。
3.4.4 线性规模及检出限 在不异尝试前提下用SWV研讨了TF氧化峰电流Ipa随其浓度变更干系。尝试成果标明，TF氧化峰电流Ipa与其浓度在0.8～20
SymbolmA@ mol/L规模内呈杰出线性干系，线性方程为Ipa（
SymbolmA@ A）＝0.74＋0.23C（
SymbolmA@ mol/L）， R＝0.9973；检出限（S/N＝3）为7.6×10
Symbolm@@ 8 mol/L。
3.4.5 现实样品测定 取市售延胡索酸泰妙菌素打针液5支，混匀，取适当该溶液置于100 mL容量瓶，用水定容。利用SWV方式对此溶液停止测定，插手已知量TF规范品停止收受接管率测定，测定成果见表1。
表1 TF打针液中TF含量及收受接管率测定成果（n＝6）
Table 1 Determination results of TF in injection samples（n＝6）
样品
Samples标示量
Labeled测得值
Found（mg）RSD（%）插手量Added（mg）测得值Found（mg）收受接管率Recovery（%）
1230.125 mg/支（ampoule）0.1252.20.0630.189101.8
0.1271.10.0750.20198.6
0.1272.90.0880.21599.7
由表1可知，所测得TF样品的绝对规范误差在1.1%～2.9%，加标收受接管率在98.6%～101.8%之间，标明本方式紧密度和精确度合适定量测定请求。 成果标明，TF电催化氧化是受分散步骤节制的电极反映进程，且AB-ILs/GCE对TF的电催化氧化具备杰出的电催化感化。同时测定了电极进程能源学参数，据此成立了TF电化学定量测定方式。
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Electrochemical Behaviors and Electrochemical Determination of
Tiamulin Fumarate at Acetylene Black-Ionic Liquid
Modified Glassy Carbon Electrode
CHEN Ji-Wen.1, DUAN Cheng-Qian1,2, GAO Zuo-Ning1,CHEN De-Gang.3
.1（Key Lab of Energy Source and Chemical Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering,
Ningxia University, Yinchuan 750021， China）
.2（Higher Vocational College, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004， China）
.3（Duowei Tairui Pharmacy Limited Company, Yinchuan 750004， China）
Effect of Aminopeptidase Inhibitor on Differentiation Induction Activity of All-trans Retinoic Acid in Human Acute Promyelocytic Leukemia NB4 Cells and Its Mechanism
Abstract
This study was purposed to investigate whether aminopeptidase inhibitor，bestatin，can potentiate all-trans retinoic acid (ATRA)-inducing differentiation in NB4 cells，and to explore its mechanism. The NB4 cells were exposed to either bestatin and ATRA alone or in combination，the morphological changes of NB4 cells were observed by optical microscopy，the CD11b expression was measured by flow cytometry，the function of defferentiation cells was analyzed by nitroblue-tetrazolium (NBT) reduction assay，the mRNA expressions of c-myc and c-EBPε in NB4 cells were detected by RT-PCR，the c-Myc protein expression was determined by Western blot. The results showed that treatment with bestatin alone induced no significant changes in morphology，NBT reduction activity and CD11b expression in NB4 cells. NB4 cells incubated with 10 nmol/L ATRA plus 100 μg/ml bestatin showed more morphologic feature of metamyelocyte and band neutrophil than ATRA alone treated cells. 100 μg/ml bestatin enhanced the NBT reduction activity in NB4 cells induced by various concentrations of ATRA (10，20，40 nmol/L). The effects of various concentrations of ATRA in combination with 100μg/ml bestatin were statistically different from the effect of ATRA alone (P
Key words bestatin; ATRA; cell line，NB4; differentiation
氨肽酶按捺剂乌苯美司（bestatin）能按捺氨肽酶N/CD13和亮氨酸氨基肽酶活性，经由进程加强宿主免疫功效及引诱肿瘤细胞凋亡等阐扬抗肿瘤感化［1，2］。有研讨提醒，bestatin可以或许或许引诱U937细胞的分解［1］，国际未见报道。咱们以NB4细胞为研讨工具，经由进程形状、功效和外表分解抗原等多条理尝试研讨，领会bestatin是不是能引诱NB4细胞分解及（或）对ATRA的引诱分解感化的加强效应，并开端切磋其可以或许或许的机理。
资料和方式
首要试剂
Bestatin、ATRA均购于Sigma公司。bestatin以无菌去离子水消融为1 mg/ml，分装以后-20℃保管；ATRA以无水乙醇消融成10-5 mol/L的贮存液，4℃避光保管，利用时用RPMI 1640细胞培育液将其浓缩为响应任务浓度。NBT为BBI公司产品，以PBS配成0.1%溶液，过滤除菌后4℃避光保管，利用前1周内配制。RPMI 1640为Gibco公司产品。胎牛血清为JRH公司产品。CD11b-FITC标记单克隆抗体为Teotech公司产品。CD13-PE标记单克隆抗体为Becton Dickinson公司产品。TRIzoL试剂为Gibco公司产品，M-MLV逆转录酶和Taq DNA分解酶为Promega公司产品。鼠抗人c-Myc单克隆抗体（c-33）及羊抗人β-Actin多克隆抗体（I-19）均为Santa Cruz公司产品，利用时以TBST液别离按1∶500和1∶1 000浓缩。ECL显色液为Santa Cruz公司产品。
细胞培育及药物处置
人APL细胞株NB4细胞（浙江大学肿瘤研讨所惠赠）及人髓细胞白血病细胞株HL-60细胞培育于含10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培育液中，置37℃、5% CO2培育箱中培育，2-3天传代1次。尝试时取对数发展期的细胞，调剂细胞密度为7×104/ml，以差别浓度ATRA和bestatin零丁或结合处置，于差别时候搜集细胞停止尝试。
细胞形状学察看
取空缺对照组及药物处置各组细胞悬液，离心，制备涂片，瑞氏-姬姆萨染色，用光学显微镜（Leica，40×10）察看细胞形状。
四氮唑蓝（nitroblue-tetrazolium，NBT）复原尝试
按文献［3］报道的方式停止。空缺对照组及药物处置各组细胞与NBT共孵育后，制备涂片，瑞氏-姬姆萨染色，光学显微镜下（100×10）察看，胞浆内含有蓝玄色颗粒者为阳性细胞，随机计数200个细胞，计较阳性细胞百分率。
细胞外表分解抗原CD11b和CD13的检测
取对数发展期HL-60细胞和NB4细胞或药物处置后各组NB4细胞离心，用PBS（pH 7.4）洗濯，调剂细胞数为2×105/50 μl，加CD13-PE标记单克隆抗体8 μl或CD11b-FITC标记单克隆抗体5 μl，避光孵育30分钟，用PBS洗濯，下流式细胞仪检测。以Cellquest 1.2软件停止阐发。
细胞总RNA提取和RT-PCR反映
总RNA提取 用TRIzoL一步法抽提细胞总RNA，按试剂申明书操纵。甲醛变性凝胶电泳证明为完全RNA，紫外分光光度仪定量，A260 nm/280 nm比值均在1.8-2.0之间。
逆转录反映
样品总RNA 4 μg及随机引物0.5 μg，70℃ 5分钟，当即冰浴，离心。顺次加5×逆转录酶缓冲液5 μl、10 mmol/L dNTP 1.25 μl、M-MLV 200 U，RNase按捺剂0.6 μl，DEPC水补至反映体积为25 μl，于27℃10分钟，37℃ 60分钟，72℃ 10分钟灭活逆转录酶，冰浴1分钟，竣事反映。
PCR反映
PCR引物为上海Sangon公司分解。引物序列、反映前提及产品巨细见表1。反映体系包含逆转录产品2 μl、10×PCR缓冲液2.5 μl、25 mmol/L MgCl2 1.5 μl、10 mmol/L dNTP 0.5 μl、25 μmol/L(c-myc与c-EBPε)或2.5 μmol/L(β-actin)下流及下流引物各0.5 μl、Taq DNA聚合酶1U，用灭菌去离子水补至终体积为25 μl。预尝试肯定产品与轮回之间呈线性干系规模。取5 μl反映产品在15 g/L琼脂糖凝胶（含0.5 μg/ml溴化乙锭）电泳，电场强度5 V/cm，紫外灯下察看电泳成果，用凝胶成像体系（BIO-RAD公司）扫描阐发条带灰度，以目标基因与β-actin的灰度比做半定量阐发。Table 1. Sequences of primers，condition of PCR and sizes of PCR products（略）
Western blot
搜集药物处置各组细胞（细胞数为2×106/ml），预冷的PBS漂洗2次，重悬于100 μl Lammiulis上样缓冲液（0.125 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，4%SDS，5%甘油）中，超声波裂解，于4℃离心13 000×g）15分钟，搜集上清，卵白样品保管于-80℃。按卵白定量试剂盒（Bio-Rad公司）操纵申明书停止卵白定量，在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，转移后的硝酸纤维素膜以5%脱脂奶粉封锁1小时，别离与抗人c-Myc和抗人β-actin抗体及辣根过氧化酶标记的二抗孵育。ECL显色，显影于胶片。图象阐发处置体系（Image Station 2000R）扫描，测定条带的面积和灰度，以二者之乘积停止半定量比拟阐发。
统计学阐发处置
各项尝试反复3次以上，以X±D表现，多组间比拟F查验后接纳方差阐发及Tukey查验。相干阐发接纳Pearson相干。利用SPSS 10.0统计软件停止统计阐发。
成果
NB4细胞外表有CD13的抒发
NB4细胞CD13阳性抒发率为94.79%（均匀荧光强度为1739.59），对照组HL-60细胞CD13阳性抒发率为95.49%（均匀荧光强度为3107.49）。二者的CD13均匀荧光强度有必然的差别，但阳性百分率差别不较着。
Bestatin与ATRA结合处置后NB4细胞形状转变较着
100 μg/ml bestatin零丁感化72小时后，NB4细胞形状无较着转变。10 nmol/L ATRA零丁感化72小时后，NB4细胞显现局局部解的形状，细胞核/浆比例减小，核变小有凸起。100 μg/ml bestatin与10 nmol/L ATRA结合处置72小时后，NB4细胞形状分解加倍较着，细胞浆内空泡增添，核凸起、歪曲加倍较着，形状似晚幼粒及杆状核粒细胞的细胞增添（图1）。
Bestatin与ATRA结合利用后NB4细胞NBT复原才能较着增添
以必然浓度（50、75和100 μg/ml）bestatin零丁处置72小时后，NB4细胞的NBT复原才能无较着转变（与空缺对照组比拟较，P>0.05）；差别浓度（10、20和40 nmol/L）ATRA感化72小时后，NB4细胞的NBT复原才能呈浓度依靠性增添，与空缺对照组比拟，差别较着。100 μg/ml bestatin与差别浓度ATRA结合处置72小时后，NB4细胞的NBT阳性率较着地进步，与单用响应浓度ATRA组比拟，差别较着（表2）。Table 2. Effect of bestatin on the NBT reduction activity of NB4 cells induced by ATRA. (略)
100 μg/ml bestatin零丁处置细胞差别时候（48小时-96小时），NB4细胞的NBT复原才能转变不较着（与相合时候点空缺对照组比拟，P>0.05）；10 nmol/L ATRA处置细胞至72小时，起头显现NB4细胞NBT复原才能的加强，并呈时候依靠性，与相合时候点对照组比拟，有较着差别；而10 nmol/L ATRA与100 μg/ml bestatin结合处置48小时，就显现NB4细胞NBT复原才能的较着加强，且此感化随时候耽误而较着加强，与相合时候点单用10 nmol/L ATRA组比拟，差别较着（图2）。
Bestatin与ATRA结合处置后NB4细胞CD11b抒发较着加强
100 μg/ml bestatin零丁处置72小时后，NB4细胞CD11b阳性抒发率（MFI为13.4±0.6）稍有增添，但与对照组（MFI为12.3±0.9）比拟，差别不较着（P>0.05）。10 nmol/L ATRA零丁处置72小时以后，NB4细胞CD11b阳性抒发率（MFI为19.2±4.2）较着进步，与对照组比拟，差别较着（P
Bestatin和ATRA零丁及结合处置后NB4细胞c-EBPε mRNA抒发的变更
NB4细胞低抒发c-EBPε mRNA。10 nmol/L ATRA处置12小时以后，NB4细胞c-EBPε mRNA抒发程度较着进步，与对照组比拟较，差别较着(P
Bestatin和ATRA零丁及结合处置后NB4细胞c-myc抒发的变更
NB4细胞c-myc mRNA呈高程度抒发。10 nmol/L ATRA零丁处置4小时后，NB4细胞c-myc mRNA抒发降落，与空缺对照组比拟较，差别较着（P
Figure 4. Effect of bestatin and ATRA on the expression of c-myc mRNA of NB4 cells after treatment for 4 hours. M: marker; Lane 1: control. Lane 2: bestatin (100 μg/ml). Lane 3: ATRA (10 nmol/L). Lane 4: bestatin (100 μg/ml) +ATRA (10 nmol/L).
NB4细胞c-Myc卵白呈高抒发。10 nmol/L ATRA零丁处置8小时后，NB4细胞c-Myc卵白抒发程度较着降落（P
讨 论
ATRA对APL的有用医治是白血病引诱分解医治的胜利典型。但单用ATRA医治易复发及产生耐药，与其余化疗药物联用时疗效有必然的进步，但毒副反映增添。是以，寻觅可以或许或许加强ATRA引诱分解感化而毒副反映轻的药物，成为临床医治中的存眷题目之一［7，8］。比来，Hirano等［7］按照NBT复原尝试成果提出，bestatin可以或许或许加强ATRA对NB4细胞的引诱分解感化，但未做进一步的研讨。本研讨经由进程对细胞形状、功效和外表分解抗原等多条理的检测及阐发对照，标明必然浓度规模的bestatin自身不能引诱NB4细胞分解，但确能加强ATRA对NB4细胞的引诱分解感化。
Hirano等［7］以为，bestatin加强ATRA引诱分解感化可以或许或许与其按捺细胞外表CD13活性有关。本研讨成果显现，与HL-60细胞类似，NB4细胞外表CD13阳性抒发率高达94.79%，该药是不是经由进程按捺CD13抒发从而加强ATRA引诱NB4细胞分解的感化，尚待进一步研讨证明。髓系祖细胞定向分解受转录因子活性的调理。ATRA调理与髓细胞定向分解有关转录因子的抒发引诱APL细胞向中性粒细胞分解。氨基肽酶N/CD13为Ⅱ型跨膜卵白，胞内端只要8-10个氨基酸，但比来研讨报道，CD13分子可以或许或许间接到场细胞内旌旗灯号转导的进程［9］。是以，本研讨从药物对转录因子影响的角度对氨肽酶、按捺剂bestatin加强ATRA引诱分解感化的可以或许或许机制停止了开端摸索。c-EBPε为C-EBP家属转录因子之一，ATRA引诱NB4细胞向中性粒细胞标的目的分解时，药物感化2小时，c-EBPε mRNA抒发程度即起头增高，并延续增高至细胞终末分解［10］。而酪氨酸激酶按捺剂STI571加强ATRA引诱NB4细胞向中性粒细胞分解时，c-EBPε基因及卵白的抒发水均匀未进一步增高［8］。本研讨成果显现，10 nmol/L ATRA处置12小时后，NB4细胞c-EBPε mRNA抒发程度较着回升，而100 μg/ml bestatin与ATRA结合处置NB4细胞时，c-EBPε mRNA抒发却未进一步加强。这提醒bestatin可以或许或许与STI571类似，其加强ATRA对NB4细胞的引诱分解感化可以或许或许不是经由进程调理c-EBPε抒发。
原癌基因c-myc抒发非常与髓细胞性白血病的产生有关，按捺c-myc抒发可以或许或许促使白血病细胞分解及引诱细胞终末分解后的凋亡。本研讨成果显现，10 nmol/L ATRA零丁感化可以或许或许使NB4细胞c-myc的抒发下调，这与文献报道类似［11］。同时，bestatin与ATRA结合利用时c-myc抒发程度的下调感化较单用ATRA时加倍较着，且药物结合利用各组细胞的c-myc卵白抒发程度与药物引诱的NBT复原才能之间呈较着的负相干。这提醒bestatin可以或许或许经由进程与ATRA协同下调c-myc抒发，从而加强ATRA引诱NB4细胞分解的感化。1，25-(OH)2 D3在引诱HL-60细胞分解时，激活卵白激酶C，引发c-myc抒发下调［12］。bestatin是不是也经由进程激活卵白激酶C加强ATRA下调c-myc的抒发，这有待进一步研讨证明。
【参考文献】
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5谭映霞，章圣辉，尹丽慧等. 三氧化二砷和全反式维甲酸结合用药引诱NB4细胞C／EBPε mRNA和CD11b抒发的开端研讨. 临床血液学杂志，2004; 17: 108-110
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8Gianni M，Kalac Y，Ponzanelli I，et al. Tyrosine kinase inhibitor STI571 potentiates the pharmacologic activity of retinoic acid in acute promyelocytic leukemia cells: effects on the degradation of RAR alpha and PML-RAR alpha. Blood，2001; 97: 3234-3243
9Santos AN，Langner J，Herrmann M，et al. Aminopeptidase N/CD13 is directly linked to signal transduction pathways in monocytes. Cell Immunol，2000; 201: 22-32
